Cette méthode décrit le prélèvement Actif sur CIP10-I et l'analyse par HPLC détection fluorimétrique de la (des) substance(s) : Fumonisine B1
Données de validation : Validation complète
Substances
Informations générales
Propriétés physico-chimiques
| Nom | N° CAS | Formule chimique | Classification CMR |
|---|---|---|---|
| Fumonisine B1 | 116355-83-0 | C34H59NO15 |
|
Plus d'informations
| Nom | Masse molaire | Densité | Synonymes | Fiche toxicologique |
|---|---|---|---|---|
| Fumonisine B1 | 721,83 |
Familles de substances
- AGENTS BIOLOGIQUES
- BIOAEROSOLS
- MYCOTOXINES
Principe et informations
La détermination de la concentration en Fumonisines dans les atmosphères de travail est réalisée par prélèvement de l’aérosol de poussières contaminées à l’aide d’un échantillonneur CIP 10 muni d’un sélecteur de la fraction inhalable haute efficacité et équipé d’une coupelle rotative contenant une mousse filtrante en polyuréthane.
La masse d’aérosol prélevé peut être déterminée par pesée des coupelles avant et après prélèvement.
Les fumonisines sont extraites du média de collecte à l’aide d’un mélange de solvants. La solution d’extraction est ensuite purifiée et concentrée sur colonne d’immunoaffinité. L’analyse est réalisée par chromatographie en phase liquide avec une réaction de dérivation pré-colonne et une détection fluorimétrique des dérivés formés.
Principe de prélèvement et d'analyse
-
État physique
Particules en suspension (liquides ou/et solides) -
Type de prélèvements
Actif -
Nom du dispositif
CIP10-I -
Plus d'informations
-
Technique analytique
CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE -
Injecteur
PASSEUR A EFFET PELTIER -
Détecteur
FLUORIMETRIE
Domaine d'application
| Substance | Quantité minimum sur le dispositif | Quantité maximum sur le dispositif | Concentration minimum | Concentration maximum | Volume maximum |
|---|---|---|---|---|---|
| Fumonisine B1 | 2 ng/m3 de FB1 et 1 mg/m3 en poussières contaminées |
1200 à 4800 L |
Réactifs
- 2-MERCAPTOETHANOL
- ACIDE PHOSPHORIQUE
- EAU
- METHANOL
- O-PHTALDIALDEHYDE
- SOLUTION COMMERCIALE PBS pH 7.4
Méthode de prélèvement
Utilisation du dispositif CIP 10pour le prélèvement d'aérosols
Un dispositif de prélèvement :
Dispositif N°1
-
Type dispositif
CIP10-Inhalable -
Support ou substrat de collecte
- FILTRE EN MOUSSE POLYURETHANE
-
Commentaires, conseils et consignes
Photo d'un ensemble CIP10-I et représentation schématique du sélecteur de la fraction inhalable avec la coupelle rotative en place.
Conditions de prélèvement
-
Débit de prélèvement (L/min)
10 -
Temps de prélèvement maximum en heures
8
Préparation des dispositifs de prélèvement en vue d’une intervention en entreprise
Méthode d'analyse
Principe général de l'analyse en laboratoire
Préparation d'analyse
-
Durée de conservation prélèvements avant analyse
30 jour(s) -
Conditions de conservation avant analyse
A température ambiante
-
Nombre d'étapes de préparation
5 -
Commentaires sur les étapes
Avant toutes étapes, réaliser les pesées des coupelles après prélèvement.
La première étape consiste à extraire FB1 des mousses avec un mélange 75/25 methanol/eau.
La deuxième étape consiste à diluer avec 40 mL de solution PBS.
La troisième étape consiste à fixer et purifier la fumonisine sur une colonne d'immunoaffinité (IA), contenant des anticorps monoclonaux spécifiques, greffés sur gel de Sépharose.Ces colonnes doivent être stockées entre 4 °C et 8 °C mais non congelées..
La quatrième étape consiste à extraire la fumonisine à partir de la colonne IA en déposant 1,5 mL de méthanol.
La cinquième étape consiste à concentrer si nécessaire par évoporation à sec et reprise par un mélange 50/50 méthanol/eau.
-
Durée de conservation échantillon préparé avant analyse
8 jour(s) -
Conditions de conservation échantillon préparé avant analyse
A conserver à 4 °C
5 étapes de préparation :
Étape de préparation N°1
-
Solvant ou solution
- MELANGE DE SOLVANTS
-
Type de préparation
Extraction -
Volume
10 mL -
Ultrasons
- Temps d'ultrasons : 15 min
-
Autres conditions de préparation
Récupération des poussières.
-
Commentaires
Récupération des poussières déposées sur les parois de la coupelle en effectuant 3 fois de suite l’étape suivante :
Ajouter 1 mL de solvant d'extraction dans la coupelle, la refermer avec son couvercle et la soumettre 5 minutes aux ultra-sons. Récupérer la solution d’extraction à l’aide d’une pipette pasteur en matière plastique et la transférer dans le flacon qui contient la mousse.
Étape de préparation N°2
-
Solvant ou solution
- PBS
-
Type de préparation
Dilution -
Filtration
Au besoin
-
Commentaires
Dilution avec la solution tampon : Transférer la totalité de la solution d'extraction dans un flacon de 200 mL avec la solution tampon PBS (rincer plusieurs fois le flacon qui contient la mousse avec une portion de solution tampon, aspirer au travers de la mousse avec une pipette pasteur en matière plastique, transférer dans le flacon de 200 mL).
Agiter à l’aide d’un barreau magnétique.
Si la solution est opaque car très chargée en poussières, prévoir une filtration au travers d’un cône en papier filtre (aucune perte de mycotoxines lors de la filtration sur papier filtre n’a été mise en évidence).
Étape de préparation N°3
-
Solvant ou solution
- PBS
-
Type de préparation
Purification -
Commentaires
Utilisation des colonnes d'immunoaffinité (conditionnement, rinçages, pratique ou non du blackflush) à adapter, le cas échéant, aux indications du fabricant.
Transférer la totalité de la solution échantillon sur une colonne d’immunoaffinité.
Prévoir un corps de seringue de 20 à 50 mL comme réservoir de distribution, à remplir en plusieurs fois, pour transférer tout le volume de solution sur la colonne
En cas de difficulté d’écoulement, amorcer celle-ci à l’aide d’un faible vide (ne jamais dépasser 5 bars).
Eliminer le mélange de solvant par soutirage sous vide (ne pas amener à sec) dans la cuve de récupération. Les mycotoxines sont maintenant liées aux anticorps monoclonaux spécifiques.
Rincer la colonne IA avec 2 fois 10 mL (par exemple) d'eau, préalablement versés dans le flacon de 200 mL ayant contenu la solution échantillon (pour une récupération complète de celle-ci).
Eliminer l’eau par soutirage à sec, en douceur et en s’assurant qu’il soit complet.
Ci-dessous : photo du dispositif.
Étape de préparation N°4
-
Solvant ou solution
- MELANGE DE SOLVANTS
-
Type de préparation
Extraction -
Commentaires
Protocole d’extraction à adapter, le cas échéant, aux indications du fabricant (en particulier pour la pratique ou non du backflush).
Remplacer la cuve de récupération par le portoir équipé des flacons de récupération et s’assurer que les aiguilles plongent jusqu’au fond des flacons
Déposer le solvant en haut de la colonne, laisser passer au-travers de la colonne par gravité, recueillir dans le flacon.
Si la colonne le permet, la technique du backflush avec trois passages successifs permet ensuite d’améliorer le rendement de récupération des mycotoxines :
Aspirer la solution recueillie dans le flacon à l’aide d’une seringue ajustée sur la colonne d’immunoaffinité. Le liquide passe dans la colonne en sens inverse, il est recueilli au-dessus de la phase solide. Laisser repasser la solution au-travers de la colonne par gravité, recueillir dans le flacon. Reproduire cette étape 2 fois de suite.
Récupérer la totalité de l’éluat par soutirage à sec, en douceur et en s’assurant qu’il soit complet, mais sans excès sous peine d’éclaboussures et de perte de produit.
Ci-dessous : photo du dispositif.
Étape de préparation N°5
-
Type de préparation
Concentration -
Évaporation
- Température : 35 °C
- Gaz : Azote
-
Commentaires
L’extrait contenu dans les flacons de récupération est évaporé à sec sous flux d’azote de la façon suivante :
Déposer les flacons, sans leur bouchon, dans les blocs de l’évaporateur prévu à cet effet (T=35°C, débit d’azote 0,4 PSI).
Faire descendre les aiguilles au dessus des flacons sans qu’elles ne trempent dans l’extrait.
Effectuer cette étape de concentration pendant 1 heure à 1 heure 30.
Descendre les aiguilles au fur et à mesure de l’évaporation.
Lorsque l’extrait est complètement évaporé : retirer les flacons, remettre leur bouchon pour effectuer la pesée du flacon contenant le résidu sec.
Reprendre le résidu par 200 µL de solvant.
Dérivation
-
Moment de la dérivation
• analyse pré-colonne -
Réactif
o-PHTALDIALDEHYDE(OPA)
Description
Dérivation pré-colonne
Une condition analytique :
Condition analytique N°1
-
Technique analytique
- CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE
-
Injecteur
- PASSEUR A EFFET PELTIER
-
Colonne
- PHASE INVERSE C18
-
Détecteur
- FLUORIMETRIE
-
Phase mobile
- EAU
- METHANOL
Étalonnage et expression des résultats
La technique d'étalonnage utilisée lors du développement de la méthode revêt un caractère obligatoire pour atteindre le niveau de performances indiqué (sensibilité, rendements, précision).
-
Principe d'étalonnage
externe -
Solvant de l’étalon
- Même solvant que celui des échantillons
-
Commentaires
Les solutions étalons sont préparées à partir du produit de référence et purifiées et concentrées (comme les échantillons) sur colonne d’immunoaffinité.
Les informations détaillées sur l'étalonnage sont fournies avec les données de validation (Validation-Compléments pour l'ochratoxine et la zéaralénone ou Validation-Compléments pour les aflatoxines).
Bibliographie
- [1] Castegnaro M., Falcy M. - Manipulation des substances génotoxiques utilisées au laboratoire. Prévention et sécurité. Brochure ED 769, Paris, INRS, Mise à jour 2001.
- [2] NF X 43-262, Qualité de l’air - Air des lieux de travail - Prélèvement d'aérosols solides à l'aide d'une coupelle rotative (fractions alvéolaire, thoracique et inhalable). AFNOR, La Plaine Saint-Denis, (Mars 2012).
- [3] EuraChem - Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement, www.measurementuncertainty.org
- [4] Évaluation des données de mesure - Guide pour l’expression de l’incertitude de mesure. GUM 1995 avec des corrections mineures. Working Group 1 of the Joint Committee for Guides in Metrology (JCGM/WG 1) JCGM 100:2008(F)
- [5] GÖRNER P., WROBEL R., MICKA V., DENIS J., FABRIÈS J. F. - Performance Testing of several respirable aerosol samplers, Advances in the Prevention of Occupational Respiratory Diseases (Excerpta Medica International Congress Series vol 1153), eds K. Chiyotani, Y. HosodaY, Y. Aizawa, Elsevier Tokio, 1998, 1013-1018.
- [6] EN 13890:2009. Workplace atmospheres. Procedures for measuring metals and metalloids in airborne particles. Requirements and test methods. CEN, Brussels.
- [7] NF EN 482. Exposition sur les lieux de travail. Exigences générales concernant les performances des procédures de mesure des agents chimiques. AFNOR, La Plaine Saint-Denis (Juillet 2012).
Historique
| Version | Date | Modification(s) faisant l’objet |
|---|---|---|
| 118/V01.01 | 08/02/2012 | Création |
| 118/V01.02 | 23/02/2012 | Légères modifications |
| 118/V02.01 | 31/01/2013 | Révision de la terminologie Modifications concernant le prélèvement et l’analyse Mise à jour des données de validation Introduction de l’annexe 3 |
| M-46/V01 | Novembre 2015 | Mise en ligne |
| M-46/V02 | Mars 2018 | Complément d'information pour la dérivation |
Date de mise à jour : mars 2018
Ancien numéro de fiche MétroPol : 118