Cette méthode décrit le prélèvement Actif sur CIP10-I et l'analyse par HPLC détection fluorimétrique de la (des) substance(s) : AOZ
Données de validation : Validation complète
- Données de validation pour "Aflatoxine B1" (PDF 109,02 Ko)
- Données de validation pour "Aflatoxine B2" (PDF 109,02 Ko)
- Données de validation pour "Aflatoxine G1" (PDF 109,02 Ko)
- Données de validation pour "Aflatoxine G2" (PDF 109,02 Ko)
- Données de validation pour "Ochratoxine A" (PDF 116,93 Ko)
- Données de validation pour "Zéaralénone" (PDF 116,93 Ko)
Substances
Informations générales
Propriétés physico-chimiques
Nom | N° CAS | Formule chimique | Classification CMR |
---|---|---|---|
Aflatoxine B1 | 1162-65-8 | C17H12O6 | |
Aflatoxine B2 | 7220-81-7 | C17H14O6 | |
Aflatoxine G1 | 1165-39-5 | C17H12O7 | |
Aflatoxine G2 | 7241-98-7 | C17H14O7 | |
Ochratoxine A | 303-47-9 | C20H18ClNO6 | |
Zéaralénone | 17924-92-4 | C18H22O5 |
Plus d'informations
Nom | Masse molaire | Densité | Synonymes | Fiche toxicologique |
---|---|---|---|---|
Aflatoxine B1 | 312,27 | |||
Aflatoxine B2 | 314,29 | |||
Aflatoxine G1 | 328,27 | |||
Aflatoxine G2 | 330,29 | |||
Ochratoxine A | 403,83 | OTA | ||
Zéaralénone | 318,4 | ZEA |
Familles de substances
- AGENTS BIOLOGIQUES
- BIOAEROSOLS
- MYCOTOXINES
Principe et informations
La détermination des concentrations en aflatoxines, ochratoxine A ou zéaralénone dans les atmosphères de travail est réalisée par:
- prélèvement de l’aérosol de poussières contaminées à l’aide d’un échantillonneur CIP 10 muni d’un sélecteur de la fraction inhalable haute efficacité, équipé d’une coupelle rotative contenant une mousse filtrante en polyuréthane ;
- pesée des coupelles avant et après prélèvement pour déterminer la masse d’aérosol prélevé ;
- extraction des mycotoxines du média de collecte à l’aide d’un mélange de solvants ;
- purification et concentration de la solution d’extraction sur une colonne d’immunoaffinité AOZ, qui contient les anticorps de l'ochratoxine A, de la zéaralénone et de 4 aflatoxines ;
- analyse de l'une ou l'autre de ces mycotoxines (en 2 injections successives) par chromatographie en phase liquide avec détection fluorimétrique.
L'intérêt de cette méthode réside dans l'utilisation d'une colonne d'immuno-affinité "multi-mycotoxines" qui permet de rechercher et doser simultanément l'une ou l'autre des mycotoxines sur un même prélèvement d'air, sans avoir à faire le choix a priori de la mycotoxine étudiée.
Principe de prélèvement et d'analyse
-
État physique
Particules en suspension (liquides ou/et solides) -
Type de prélèvements
Actif -
Nom du dispositif
CIP10-I -
Plus d'informations
-
Technique analytique
CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE -
Injecteur
PASSEUR A EFFET PELTIER -
Détecteur
FLUORIMETRIE
Domaine d'application
Substance | Quantité minimum sur le dispositif | Quantité maximum sur le dispositif | Concentration minimum | Concentration maximum | Volume maximum |
---|---|---|---|---|---|
Aflatoxine B1 | 180 pg |
900 pg |
|||
Aflatoxine B2 | 1500 pg |
6000 pg |
|||
Aflatoxine G1 | Voir Données de validation-Données 2 |
Voir Données de validation-Données 2 |
|||
Aflatoxine G2 | 60 pg |
400 pg |
|||
Ochratoxine A | 300 pg |
1300 pg |
|||
Zéaralénone | 20 ng |
70 ng |
Réactifs
- ACETONITRILE
- ACIDE ACETIQUE
- EAU ULTRAPURE
- METHANOL
- SOLUTION COMMERCIALE PBS pH 7,4
Méthode de prélèvement
Utilisation du dispositif CIP 10 pour le prélèvement d'aérosols
Un dispositif de prélèvement :
Dispositif N°1
-
Type dispositif
CIP10-Inhalable -
Support ou substrat de collecte
- FILTRE EN MOUSSE POLYURETHANE
-
Commentaires, conseils et consignes
Photo d'un ensemble CIP10-I et représentation schématique du sélecteur de la fraction inhalable avec la coupelle rotative en place.
Conditions de prélèvement
-
Débit de prélèvement (L/min)
10 -
Temps de prélèvement maximum en heures
8
Préparation des dispositifs de prélèvement en vue d’une intervention en entreprise
Méthode d'analyse
Principe général de l'analyse en laboratoire
Préparation d'analyse
-
Durée de conservation prélèvements avant analyse
30 jour(s) -
Conditions de conservation avant analyse
A température ambiante
-
Nombre d'étapes de préparation
4 -
Commentaires sur les étapes
Réaliser les pesées des coupelles (après prélèvement) avant les étapes de préparation de l'analyse.
Préparation de l'analyse :
La première étape consiste à extraire les poussières contaminées des coupelles, avec un mélange 60/40 acétonitrile/eau (mélange de solvants de l'étape de préaparation 1).
La deuxième étape consiste à diluer avec 100 mL de solution PBS.
La troisième étape consiste à fixer et purifier les mycotoxines, sur une colonne d'immunoaffinité (IA -AOZ) contenant des anticorps monoclonaux greffés sur gel de Sépharose. Ces colonnes doivent être stockées entre 4 °C et 8 °C mais non congelées.
La quatrième étape consiste à extraire les mycotoxines à partir de la colonne IA-AOZ en déposant successivement1,5 mL de méthanol puis 1,5 mL d'eau à 0.1 % d'acide acétique.
-
Durée de conservation échantillon préparé avant analyse
8 jour(s) -
Conditions de conservation échantillon préparé avant analyse
Conservation à 4 ± 2 °C
4 étapes de préparation :
Étape de préparation N°1
-
Solvant ou solution
- MELANGE DE SOLVANTS
-
Type de préparation
Extraction -
Volume
10 mL -
Ultrasons
- Temps d'ultrasons : 15 min
-
Autres conditions de préparation
Récupération des poussières.
-
Commentaires
Récupération des poussières déposées sur les parois de la coupelle en effectuant 3 fois de suite l’étape suivante :
Ajouter 1 mL de solvant d'extraction dans la coupelle, la refermer avec son couvercle et la soumettre 5 minutes aux ultra-sons. Récupérer la solution d’extraction à l’aide d’une pipette pasteur en matière plastique et la transférer dans le flacon qui contient la mousse.
Étape de préparation N°2
-
Solvant ou solution
- PBS
-
Type de préparation
Dilution -
Filtration
Au besoin
-
Commentaires
Dilution avec la solution tampon : Transférer la totalité de la solution d'extraction dans un flacon de 200 mL avec la solution tampon PBS (rincer plusieurs fois le flacon qui contient la mousse avec une portion de solution tampon, aspirer au travers de la mousse avec une pipette pasteur en matière plastique, transférer dans le flacon de 200 mL).
Agiter à l’aide d’un barreau magnétique.
Si la solution est opaque car très chargée en poussières, prévoir une filtration au travers d’un cône en papier filtre (aucune perte de mycotoxines lors de la filtration sur papier filtre n’a été mise en évidence).
Étape de préparation N°3
-
Solvant ou solution
- PBS
-
Type de préparation
Purification -
Commentaires
Utilisation des colonnes d'immunoaffinité (conditionnement, rinçages, pratique ou non du blackflush) à adapter, le cas échéant, aux indications du fabricant.
Transférer la totalité de la solution échantillon sur une colonne d’immunoaffinité.
Prévoir un corps de seringue de 20 à 50 mL comme réservoir de distribution, à remplir en plusieurs fois, pour transférer tout le volume de solution sur la colonne
En cas de difficulté d’écoulement, amorcer celle-ci à l’aide d’un faible vide (ne jamais dépasser 5 bars).
Eliminer le mélange de solvant par soutirage sous vide (ne pas amener à sec) dans la cuve de récupération. Les mycotoxines sont maintenant liées aux anticorps monoclonaux spécifiques.
Rincer la colonne IA avec 2 fois 10 mL (par exemple) d'eau, préalablement versés dans le flacon de 200 mL ayant contenu la solution échantillon (pour une récupération complète de celle-ci).
Eliminer l’eau par soutirage à sec, en douceur et en s’assurant qu’il soit complet.
Ci-dessous : photo du dispositif.
Étape de préparation N°4
-
Solvant ou solution
- METHANOL puis EAU Acidifiée
-
Type de préparation
Extraction -
Commentaires
Protocole d ’extraction à adapter, le cas échéant, aux indications du fabricant (en particulier pour la pratique ou non dubackflush).
Remplacer la cuve de récupération par le portoir équipé des flacons de récupération et s’assurer que les aiguilles plongent jusqu’au
fond des flacons.Déposer 1,5 mL de méthanol en haut de la colonne, laisser passer au-travers de la colonne par gravité, recueillir dans le flacon.
Déposer ensuite 1,5 mL d'eau à 0,1 % d'acide acétique en haut de la colonne, laisser passer au-travers de la colonne par gravité, recueillir dans le flacon.
Si la colonne le permet, la technique du backflush avec trois passages successifs permet ensuite d’améliorer le rendement de récupération des mycotoxines :
Aspirer la solution recueillie dans le flacon à l’aide d’une seringue ajustée sur la colonne d’immunoaffinité. Le liquide passe dans la colonne en sens inverse, il est recueilli au-dessus de la phase solide. Laisser repasser la solution au-travers de la colonne par gravité,Déposer ensuite 1,5 mL d'eau à 0,1 % d'acide acétique en haut de la colonne, laisser passer au-travers de la colonne par gravité, recueillir dans le flacon. Reproduire cette étape deux fois de suite.
Ci-dessous : photo du dispositif
Dérivation
-
Moment de la dérivation
lors d’un traitement post-colonne -
Réactif
BROME -
Nom du dérivé formé et numéro CAS correspondant
Dérivés bromés des aflatoxines B1 et G1 qui ne fluorescent que très faiblement naturellement (contrairement aux aflatoxines B2 et G2).
Description
Montage d'un système de dérivation post-colonne (Kobra cell) ou équivalent.
Une condition analytique :
Condition analytique N°1
-
Technique analytique
- CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE
-
Injecteur
- PASSEUR A EFFET PELTIER
-
Colonne
- PHASE INVERSE C18
-
Détecteur
- FLUORIMETRIE
-
Phase mobile
- ACETONITRILE
- EAU
- METHANOL
-
Commentaires, conseils ou condition particulières
L'analyse se fait en deux temps :
- La première injection correspond à l'analyse de l'ochratoxine et/ou de la zéaralénone sans dérivation, avec la même phase mobile mais des longueurs d'onde d'excitation et d'émission programmées, adaptées au mélange des deux substances. Les longueurs d'onde choisies peuvent donc ne plus correspondre à celles pour laquelle la réponse de chaque substance est optimale.
- Une 2ième injection du même extrait, sur la même colonne mais avec une autre phase mobile et des conditions de détection fluorimétrique différentes (dérivation post-colonne et longueurs d'onde d'excitation et d'émission adaptées), permet l'analyse des aflatoxines.
Étalonnage et expression des résultats
La technique d'étalonnage utilisée lors du développement de la méthode revêt un caractère obligatoire pour atteindre le niveau de performances indiqué (sensibilité, rendements, précision).
-
Principe d'étalonnage
externe -
Solvant de l’étalon
- Même solvant que celui des échantillons
-
Commentaires
Les solutions étalons sont préparées à partir du produit de référence et purifiées et concentrées (comme les échantillons) sur colonne d’immunoaffinité.
Les informations détaillées sur l'étalonnage sont fournies avec les données de validation (Validation-Compléments pour l'ochratoxine et la zéaralénone ou Validation-Compléments pour les aflatoxines).
Historique
Version | Date | Modification(s) faisant l’objet |
---|---|---|
M-339/V01 | mars 2016 | Création |
M-339/V02 | mars 2018 | Complément d'informations dans la méthode d'analyse |
Date de mise à jour : mars 2018