MétroPol Endotoxines M-154

Substances

Informations générales

Propriétés physico-chimiques

Plus d'informations

Familles de substances

• AGENTS BIOLOGIQUES
• BIOAEROSOLS

Principe et informations

Principe de prélèvement et d'analyse

• État physique

  Particules en suspension (liquides ou/et solides)

• Type de prélèvements

  Actif

• Nom du dispositif

  cassette

• Technique analytique

  SPECTROPHOTOMETRIE

Domaine d'application

Aucun domaine d'application défini.

Réactifs

• EDSA
• ENDOTOXINES LYOPHILISEES DE ESCHERICHIA COLI 055:B5
• REACTIF LAL LYOPHILISE

manpi des labo

Méthode de prélèvement

Prélèvement des aérosols par cassette fermée

Un dispositif de prélèvement :

Dispositif N°1

• Type dispositif

  CASSETTE 37 mm 3 pièces

• Support ou substrat de collecte

  • FILTRE FIBRE DE VERRE
  • TAMPON EN CELLULOSE

• Préparation du substrat

   Les filtres en fibre de verre sont dépyrogénéisés à l'étuve à 250°C pendant 90 minutes.

• Commentaires, conseils et consignes

  La préparation des cassettes de prélèvement est effectuée sous PSM (Poste Sécurité Microbiologique) en déposant un tampon cellulose puis un filtre en fibre de verre à l'aide d'une pince stérile. La cassette est ensuite correctement assemblée puis fermée avec des bouchons. Elle doit être étanche. Il est recommandé d'utiliser un lot de cassettes non ouvert et stocké à l'abri de la lumière et la poussière.

  

   

Conditions de prélèvement

• Débit de prélèvement (L/min)

  2

• Temps de prélèvement maximum en heures

  8

• Particularités, commentaires, conseils

  Volume de prélèvement recommandé : entre 300 et 400 L

Pompe de prélèvement

• Pompe à débit de 1 à 5 L/min compensant les fortes pertes de charges (sup, à 20 pouces d'eau)

Conditionnement particulier

• Choix conditionnement particulier

  autre

• Description

  Toutes les dispositions concernant l'assemblage et l'étanchéité des cassettes devront être vérifiées.

  Les échantillons sont transportés le plus rapidement possible au laboratoire dans une enceinte réfrigérée à 4°C. Dans tous les cas, les échantillons doivent être analysés dans les 24 heures après le prélèvement.

  Remarque : Le peu de données disponibles actuellement ne permet pas de mieux préciser les conditions de conservation des filtres après l'échantillonnage.

Compléments

Préparation des dispositifs de prélèvement en vue d'une intervention en entreprise

Méthode d'analyse

Principe général de l'analyse en laboratoire

Préparation d'analyse

• Durée de conservation prélèvements avant analyse

  1 jour(s)

• Conditions de conservation avant analyse

  4°C

• Nombre d'étapes de préparation

  1

• Commentaires sur les étapes

  Tout matériel utilisé doit être vérifié et certifié apyrogène à une concentration inférieure à 0.005EU/ml et ne doit pas interférer dans le dosage des endotoxines notamment par absorption des endotoxines sur les parois.

Une étape de préparation :

Étape de préparation N°1

• Solvant ou solution

  • EAU

• Type de préparation

  Extraction

• Volume

  10 mL

• Temps d'agitation

  60 min

• Commentaires

  Extraction des endotoxines à partir des filtres dans un volume de10 mL d’eau purifiée stérile et apyrogène.

  Agitation 60 min à 2 000 rpm à l’aide d’un vortex.

  Centrifugation des extraits pendant 10 min à 4°C et 2000g.

  Filtration éventuelle des extraits s’ils restent troubles après centrifugation.

  Remarque :
  Traiter les témoins de la même façon.

  En cas de dépôt évident de poussières sur les parois de la cassette, un lavage de la cassette après retrait du filtre de prélèvement et du pad peut être réalisé et les endotoxines dosées séparément.

Commentaires, conseils, conditions particulières

Une condition analytique :

Condition analytique N°1

• Technique analytique

  • SPECTROPHOTOMETRIE

• Commentaires, conseils ou condition particulières

  Dosage des endotoxines dans les extraits

  Le dosage des endotoxines dans les extraits doit être effectué le plus rapidement possible après l’extraction. Ce dosage est effectué avec la méthode cinétique et chromogénique au LAL. La présente procédure décrit une méthode de dosage utilisant le kit LAL Kinetic-QCL.

  Le dosage des endotoxines est réalisé sur deux exemplaires des solutions décrites dans le tableau 1. Pour chaque échantillon, une dilution au 1/10^e voire au 1/100 ^e peut être effectuée. Préalablement à l’analyse, les échantillons sont correctement identifiés et un plan de plaque est prédéfini.

  

  • Étape n° 1 : Préparer la gamme étalon.
  • Étape n° 2 : Préparer les échantillons.

  Les extraits sont dilués successivement au 1/10^e dans de l’EDSA. Les tubes en verre stériles et apyrogènes sont utilisés pour cette opération et le taux de dilution est fonction de la concentration attendue en endotoxines.

  • Étape n° 3 : Distribuer les échantillons dans la plaque de microtitration.

  La gamme étalon, les témoins (contrôles positifs, contrôles négatifs) et les échantillons sont distribués dans une plaque de microtitration stérile et apyrogène, dans les puits appropriés (plan de plaque prédéfini) et à raison de 100 µL par puits.

  • Étape n° 4 : Pré-incubation de la plaque de microtitration.

  La plaque de microtitration est ensuite introduite dans le lecteur  puis incubée à 37°C pendant 10 minutes.

  • Étape n° 5 : Préparer le réactif LAL.

  La préparation du réactif LAL est effectuée au cours des dix minutes de pré-incubation de la plaque de microtitration à l’aide des flacons contenant le réactif LAL lyophilisé  et d’EDSA  présents dans le kit. Le réactif est préparé en ajoutant à chaque flacon de réactif LAL lyophilisé le volume d’EDSA indiqué par le fournisseur. Le mélange est ensuite homogénéisé délicatement. Si la préparation nécessite plusieurs flacons de réactif LAL, homogénéiser chaque flacon séparément puis regrouper la totalité du réactif préparé dans un seul flacon.

  • Étape n° 6 : Distribuer le réactif LAL dans la plaque de microtitration.

  Le réactif LAL préparé est distribué, à l’aide d’un distributeur Combitypâ, dans les puits appropriés (plan de plaque prédéfini) de la plaque de microtitration pré-incubée et à raison de 100 µL par puits.

  La réaction s’initie dès lors que le réactif LAL est mis en contact avec une solution contenant des endotoxines. Aussi, la distribution du réactif LAL doit être aussi régulière que possible et sa durée ne doit pas excéder 90 secondes (le logiciel déduit 5 secondes par colonne).

  • Étape n° 7 : Incubation et lecture.

  La plaque de microtitration est immédiatement incubée sans son couvercle dans le lecteur de plaque à 37°C. Le lecteur, piloté par le logiciel Win-KQCLä  est paramétré de façon à effectuer
  une lecture de la densité optique (DO) de chaque puits à 405 nm, toutes les 150 secondes pendant 1 h 40.

   

  PRÉCAUTIONS PARTICULIÈRES

  • Les endotoxines peuvent avoir des effets sur la santé et il est nécessaire de les manipuler avec précaution. En particulier, tous les réactifs seront manipulés sous poste de sécurité microbiologique (PSM). De même, lors de la manipulation des échantillons, toutes les dispositions nécessaires doivent être prises afin de prévenir tout risque de contamination de l’opérateur (travail en conditions aseptiques, port de gants etc…).
  •  L’essai est effectué dans des conditions permettant d’éviter toute contamination par des endotoxines. La totalité des opérations (hors incubation et lecture) est faite sous PSM avec du matériel dédié, des réactifs et des consommables spécifiques (matériel stérile et apyrogène requis pour l’ensemble de l’essai). Il est important de respecter rigoureusement le choix des matériels et des modes opératoires présentés dans cette procédure. Tout matériel nouveau ou différent doit être validé exempt d’endotoxines.

  •  Les solutions d’endotoxines de référence ainsi que les solutions issues des échantillons (sauf les extraits  centrifugés ) doivent être systématiquement agitées à l’aide d’un vortex pendant 30 s avant chaque dilution, distribution, ou prise d’essai.

    Remarque :

    La liste du matériel est donnée à titre d’exemple, tout matériel utilisé doit être vérifié et certifié apyrogène à une concentration inférieure à 0.005EU/ml et ne doit pas interférer dans le dosage des endotoxines notamment par absorption des endotoxines sur les parois.

    
    

Étalonnage et expression des résultats

• Principe d'étalonnage

  interne

• Étalon interne

  La gamme étalon est préparée à partir de l’endotoxine standardisée de contrôle de Escherichia coli  sous forme lyophilisée.

• Commentaires

  • Préparer une gamme de solutions étalons de la façon suivante :

  La gamme étalon est préparée à partir des flacons d’endotoxine lyophilisée et d’EDSA disponibles dans le kit LAL-Kinetic-QCLä, conformément aux indications du fournisseur. Ce kit utilise des flacons d’endotoxine lyophilisée de Escherichia coli 055:B5 (E. coli 055 : B5 Endotoxin) et de l’EDSA. Pour préparer la solution d’endotoxine à 50 UE/mL, le flacon d’endotoxine lyophilisée est complémenté par le volume d’EDSA indiqué par le fournisseur. La solution ainsi reconstituée est ensuite agitée à l’aide d’un vortex à la vitesse de 2 500 rpm pendant 10 minutes.

  La gamme étalon d’endotoxine (de 0,005 à 50 UE/mL) est préparée dans des tubes en verre apyrogènes par dilutions successives au 1/10^e dans de l’EDSA de la solution d’endotoxine à 50 UE/mL préparée précédemment.

  • La plage de concentrations s’étend ainsi de 0,005 à 50 UE/mL.

  Remarque

  -  Un test de qualification initiale est nécessaire pour chaque manipulateur et chaque fois qu’un nouveau lot de réactifs est utilisé pour le dosage. Il doit être également effectué chaque fois qu’un changement significatif, susceptible d’affecter le résultat final, intervient dans la méthode. Le test consiste à réaliser
   le dosage des endotoxines sur une gamme étalon d’endotoxine et sur un témoin négatif (EDSA) 4 fois de suite.

  - Le test de qualification initiale est jugé conforme si le coefficient de corrélation de la courbe est supérieur à 0,98.

• Calcul de la quantité de substance sur le dispositif

  EXPRESSION DES RESULTATS

  Les résultats de dosage des endotoxines dans l’air sont exprimés en UE/m³ et calculés de la façon suivante :

  E = (e x v₀)/V

  avec :   V              :  (Q/1 000) x T

  et         V (m³)        :  volume d'air prélevé

              V_o (mL)      :  volume de solution d’extraction

              e (UE/mL)  :  concentration en endotoxines dans l’extrait

              E (UE/m³)  :  concentration en endotoxines dans l’échantillon d’air prélevé

              T (min)       :  durée du prélèvement

              Q (L/min)   :  débit de l’appareil de prélèvement

   

  ANALYSE DES RESULTATS DE DOSAGE

  Les données sont analysées à l’aide du logiciel Win-KQCLä. En utilisant la première lecture de DO dans un puits donné comme blanc interne, le logiciel calcule le temps requis pour que la DO augmente de 0,2 unité dans ce puits. Ce temps est appelé temps de réaction. La quantité d’endotoxine présente dans un puits est obtenue en comparant le temps de réaction mesuré dans celui-ci avec les temps de réaction mesurés dans les puits contenant la gamme étalon.

  Validité des résultats

  • L’essai de dosage des endotoxines n’est valable que si les conditions suivantes sont satisfaites :

  -  Le résultat obtenu pour le témoin négatif (blanc) ne doit pas dépasser le niveau du point d’étalonnage le plus bas (0,005 UE/mL).

  -  La valeur absolue du coefficient de corrélation de la courbe d’étalonnage doit être supérieure ou égale à 0,98.

  • Pour un même échantillon, les résultats du dosage ne sont valables que si les conditions suivantes sont satisfaites :

  -  Le coefficient de variation, calculé à partir des résultats de dosage obtenus pour les deux exemplaires (i.e. répétitions) d’un même échantillon, est inférieur ou égal à 10 %.

  -  La valeur de recouvrement des endotoxines à partir des ajouts dosés doit être comprise entre
  50 et 150 % de la quantité initialement introduite.

  Si ces conditions ne sont pas satisfaites, le dosage doit être recommencé.

  Gestion des interférences

  Les interférences sont mises en évidence lorsque le recouvrement des endotoxines à partir des ajouts dosés n’est pas compris entre 50 et 150 %. Pour lever ces interférences, l’analyse doit être refaite en diluant l’échantillon concerné. Si l’interférence ne peut pas être levée, le résultat d’analyse doit être accompagné d’un commentaire signalant des interférences.

   

  LIMITES DE LA METHODE

  Le seuil de détection de la méthode de dosage est de 0,005 UE/mL.

  Les résultats correspondant aux essais pour lesquels les interférences n’ont pas pu être levées sont sous-estimés s’il y a inhibition et sur-estimés s’il y a activation lors du dosage dans l’échantillon dopé.

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