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MétroPol Aflatoxines M-45

Sommaire de la fiche

Cette méthode décrit le prélèvement en mode Actif sur CIP10-I et l'analyse par HPLC détection fluorimétrique de la (des) substance(s) : Aflatoxine B1 ; Aflatoxine B2 ; Aflatoxine G1 ; Aflatoxine G2.

Substances

Informations générales

Propriétés physico-chimiques
Nom N° CAS Formule chimique Classification CMR
Aflatoxine B1 1162-65-8

C17H12O6

Aflatoxine B2 7220-81-7

C17H14O6

Aflatoxine G1 1165-39-5

C17H12O7

Aflatoxine G2 7241-98-7

C17H14O7

Plus d'informations
Nom Masse molaire Densité Synonymes Fiche toxicologique
Aflatoxine B1 312,27
Aflatoxine B2 314,29
Aflatoxine G1 328,27
Aflatoxine G2 330,29

Familles de substances

  • MYCOTOXINES

Principe et informations

La détermination de la concentration en Aflatoxines dans les atmosphères de travail est réalisée par prélèvement de l’aérosol de poussières contaminées à l’aide d’un échantillonneur CIP 10 muni d’un sélecteur de la fraction inhalable haute efficacité et équipé d’une coupelle rotative contenant une mousse filtrante en polyuréthane.

La masse d’aérosol prélevé peut être déterminée par pesée des coupelles avant et après prélèvement.

Les aflatoxines sont extraites du média de collecte à l’aide d’un mélange de solvants. La solution d’extraction est ensuite purifiée et concentrée sur colonne d’immunoaffinité. L’analyse est réalisée par chromatographie en phase liquide avec une réaction de dérivation post-colonne et une détection fluorimétrique des dérivés formés.

Principe de prélèvement et d'analyse

  • État physique

    Particules en suspension (liquides ou/et solides)
  • Type de prélèvements

    Actif
  • Nom du dispositif

    CIP10-I
  • Plus d'informations

  • Technique analytique

    CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE
  • Injecteur

    PASSEUR A EFFET PELTIER
  • Détecteur

    FLUORIMETRIE

Domaine d'application

Substance Quantité minimum sur le dispositif Quantité maximum sur le dispositif Concentration minimum Concentration maximum Volume maximum
Aflatoxine B1

 4 pg/m3 pour chacune des aflatoxines et 1 mg/m3 en poussières contaminées

1200 à 4800 L

Réactifs

  • ACETONITRILE
  • ACIDE NITRIQUE
  • BROMURE DE POTASSIUM
  • EAU
  • METHANOL
  • SOLUTION COMMERCIALE PBS pH 7.4

Consignes de sécurité pour les manipulations en laboratoire

Méthode de prélèvement

Utilisation du dispositif CIP 10pour le prélèvement d'aérosols

Un dispositif de prélèvement :

Dispositif N°1
  • Type dispositif

    CIP10-Inhalable
  • Support ou substrat de collecte

    • FILTRE EN MOUSSE POLYURETHANE
  • Commentaires, conseils et consignes

Conditions de prélèvement

  • Débit de prélèvement (L/min)

    10
  • Temps de prélèvement maximum en heures

    8


Préparation des dispositifs de prélèvement en vue d’une intervention en entreprise

Méthode d'analyse

Principe général de l'analyse en laboratoire

Préparation d'analyse

  • Durée de conservation prélèvements avant analyse

    30 jour(s)
  • Conditions de conservation avant analyse

    A température ambiante

  • Nombre d'étapes de préparation

    5
  • Commentaires sur les étapes

    Avant toutes étapes, réaliser les pesées des coupelles après prélèvement.

    La première étape consiste  à extraire les poussières contaminées par des aflatoxines, à partir des coupelles, avec un mélange 60/40 méthanol/eau.

    La deuxième étape consiste à diluer avec 30 mL de solution PBS.

    la troisième étape consiste à fixer et purifier les aflatoxines sur une colonne immunoaffinités( IA), contenant des anticorps monoclonaux spécifiques, greffés sur gel de Sépharose.Ces colonnes doivent être stockées entre 4 °C et 8 °C mais non congelées..

    La quatrième étape consiste à extraire les aflatoxines à partir d' une colonne IA en déposant 2 fois 0,5 mL de méthanol.

    La cinquième étape consiste à concentrer si nécessaire par évoporation à sec et reprise par 200 µL d'éluant chromatographique.

  • Durée de conservation échantillon préparé avant analyse

    8 jour(s)
  • Conditions de conservation échantillon préparé avant analyse

    conservation à 4°C

5 techniques de préparation d'analyse :
Technique de préparation d'analyse N°1
  • Solvant ou solution

    • MELANGE DE SOLVANTS
  • Type de préparation

    Extraction
  • Volume

    10 mL
  • Ultrasons

    • Temps d'ultrasons : 15 min
  • Autres conditions de préparation

    Récupération des poussières.

  • Commentaires

    Récupération des poussières déposées sur les parois de la coupelle en effectuant 3 fois de suite l’étape suivante :

    Ajouter 1 mL de la solution de désorption  dans la coupelle, la refermer avec son couvercle et la soumettre 5 minutes aux ultra-sons. Récupérer la solution d’extraction à l’aide d’une pipette pasteur en matière plastique et la transférer dans le flacon qui contient la mousse.

Technique de préparation d'analyse N°2
  • Solvant ou solution

    • PBS
  • Type de préparation

    Dilution
  • Filtration

    Au besoin

  • Commentaires

    Dilution avec la solution tampon : Transférer la totalité de la solution de désorption  dans un flacon de 200 mL avec la solution tampon PBS (rincer plusieurs fois le flacon qui contient la mousse avec une portion de solution tampon, aspirer avec une pipette pasteur en matière plastique, transférer dans le flacon de 200 mL).

    Agiter à l’aide d’un barreau magnétique.

    Si la solution est opaque car très chargée en poussières, prévoir une filtration au travers d’un cône en papier filtre (aucune perte de mycotoxines lors de la filtration sur papier filtre n’a été mise en évidence).

Technique de préparation d'analyse N°3
  • Solvant ou solution

    • PBS
  • Type de préparation

    Purification
  • Commentaires

    Transférer la totalité de la solution échantillon sur une colonne d’immunoaffinité.

    Prévoir un corps de seringue de 20 à 50 mL comme réservoir de distribution, à remplir en plusieurs fois, pour transférer tout le volume de solution sur la colonne

    En cas de difficulté d’écoulement, amorcer celle-ci à l’aide d’un faible vide (ne jamais dépasser 5 bars).

    Eliminer le mélange de solvant par soutirage sous vide (ne pas amener à sec) dans la cuve de récupération. Les mycotoxines sont maintenant liées aux anticorps monoclonaux spécifiques.

    Rincer la colonne IA avec 2 fois 10 mL  (par exemple) de PBS, préalablement versés dans le flacon de 200 mL ayant contenu la solution échantillon (pour une récupération complète de celle-ci).

    Eliminer l’eau par soutirage à sec, en douceur et en s’assurant qu’il soit complet.

    Ci-dessous : photo du dispositif.   

                                       

Technique de préparation d'analyse N°4
  • Solvant ou solution

    • MELANGE DE SOLVANTS
  • Type de préparation

    Extraction
  • Commentaires

    Protocole d’extraction à adapter, le cas échéant, aux indications du fabricant (en particulier pour la pratique ou non du backflush).

    Remplacer la cuve de récupération par le portoir équipé des flacons de récupération et s’assurer que les aiguilles plongent jusqu’au fond des flacons

    Déposer l'éluant en haut de la colonne, laisser passer au-travers de la colonne par gravité, recueillir dans le flacon.

    Si la colonne le permet, la technique du backflush avec trois passages successifs permet ensuite d’améliorer le rendement de récupération des mycotoxines :

    Aspirer la solution recueillie dans le flacon à l’aide d’une seringue ajustée sur la colonne d’immunoaffinité. Le liquide passe dans la colonne en sens inverse, il est recueilli au-dessus de la phase solide. Laisser repasser la solution au-travers de la colonne par gravité, recueillir dans le flacon. Reproduire cette étape 2 fois de suite.

    Récupérer la totalité de l’éluat par soutirage à sec, en douceur et en s’assurant qu’il soit complet,  mais sans excès sous peine d’éclaboussures et de perte de produit.

    Ci-dessous : photo du dispositif.

     

     

Technique de préparation d'analyse N°5
  • Type de préparation

    Concentration
  • Évaporation

    • Température : 35 °C
    • Gaz : Azote
  • Commentaires

    L’extrait contenu dans les flacons de récupération est évaporé à sec sous flux d’azote de la façon suivante :

    Déposer les flacons, sans leur bouchon, dans les blocs de l’évaporateur prévu à cet effet (T=35°C, débit d’azote 0,4 PSI).

    Faire descendre les aiguilles au dessus des flacons sans qu’elles ne trempent dans l’extrait.

    Effectuer cette étape de concentration pendant 1 heure à 1 heure 30.

    Descendre les aiguilles au fur et à mesure de l’évaporation.

    Lorsque l’extrait est complètement évaporé : retirer les flacons, remettre leur bouchon  pour effectuer la pesée du flacon contenant le résidu sec.

    Reprendre le résidu par 200 µL de solvant.

     


     

Dérivation
  • Moment de la dérivation

    lors d’un traitement post-colonne
  • Réactif

    BROME
  • Nom du dérivé formé et numéro CAS correspondant

    Dérivés bromés des aflatoxines B1, B2, G1 et G2 détectables par fluorimétrie.

Description

Montage d'un système de dérivation post-colonne (Kobra cell) ou équivalent.

Commentaires, conseils, conditions particulières

Pour assurer un temps d’analyse optimal du dérivé formé, la longueur de la tubulure entre la cellule de dérivation et l’entrée du détecteur doit être déterminée en fonction de son diamètre interne et du débit. Elle sera par exemple, de 34 cm si le diamètre interne est de 0,5 mm avec un débit 1 mL/min.

Ne jamais laisser la cellule de dérivation au brome sous un flux débit d’acétonitrile pur.

Stocker la cellule de dérivation au brome sous 100% d’eau après l’avoir conditionnée à faible débit sous acétonitrile/eau v/v (50/50).


 

Une condition analytique :

Condition analytique N°1
  • Technique analytique

    • CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE
  • Injecteur

    • PASSEUR A EFFET PELTIER
  • Colonne

    • PHASE INVERSE C18
  • Détecteur

    • FLUORIMETRIE
  • Phase mobile

    • ACETONITRILE
    • EAU
    • METHANOL

Étalonnage et expression des résultats

 La technique d'étalonnage utilisée lors du développement de la méthode revêt un caractère obligatoire pour atteindre le niveau de performances indiqué (sensibilité, rendements, précision).

  • Principe d'étalonnage

    externe
  • Solvant de l’étalon

    • Même solvant que celui des échantillons
  • Commentaires

    Les solutions étalons sont préparées à partir du produit de référence et purifiées et concentrées (comme les échantillons) sur colonne d’immunoaffinité.
    Les informations détaillées sur l'étalonnage sont fournies avec les données de validation (Validation-Compléments pour l'ochratoxine et la zéaralénone ou Validation-Compléments pour les aflatoxines).

Historique

Version

Date

Modification(s) faisant l’objet
de la nouvelle version

119/V01.01

01/03/2012

Création

119//V02.01

31/01/2013

Révision de la terminologie

Modifications concernant le  prélèvement et l’analyse

Mise à jour des données de validation

Introduction de l’annexe 3

119/V02.02

10/02/2015

Modification de l’écriture des équations (AF) et

correction des unités indiquées pour les étalons (pg et non pas ng, pg/mL et non pas ng/mL)

dans les calculs des quantités (q) et concentrations (af, AF et afc)

Correction d’une indication erronée sur le détail des flacons à installer dans le passeur automatique

 

M-45/V01 Novembre 2015 Mise en ligne

Date de mise à jour : novembre 2017

Ancien numéro de fiche MétroPol : 119